Analisis Sediaan Farmasi
Analisis Bahan Kimia Obat dalam Jamu dengan Metode KLT-Densitometer
Oleh :
Nama : Dinda Yulia Wahyuni Bahri
NIM : 18613114
Kelompok : C1
Program Studi Farmasi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Islam Indonesia
2020
1. Dapat menjelaskan prinsip dasar pemisahan senyawa secara kromatografi (KLT-Densitometri) dan aplikasinya
2. Dapat menjelaskan alasan pemilihan metode kromatografi (KLT-Densitometri) untuk analisis Bahan Kimia Obat dalam jamu
3. Dapat mempraktikkan analisis
kualitatif dan kuantitatif Bahan Kimia Obat dalam jamu
4. Dapat melakukan validasi
metode analisis sehingga hasil pengukuran dapat dipertanggungjawabkan validitas
hasilnya
II. Alat dan Bahan
Alat
1. Cawan porselin
2. Chamber
3. Densitometer
4. Gelas ukur 5 mL
5. Linomat 5
6. Pipet ukur 5 mL
7. Pipet ukur 10 mL
8. Propipet
9. Ultrasonicator
10. Waterbath
Bahan
1. Fase gerak 20 mL kloroform : aseton (80:20) (jenuh 1 jam) (yang digunkan)
2. Fase gerak 25 mL kloroform : ametanol : ammonia 10% (80:17:3) (jenuh 1 jam)
3. Kertas saring
4. Sampel jamu serbuk
5. Silica gel 60 F254
6.
Standart
fenibutasol
7. Standart parasetamol
III. Cara Kerja (Rencana)
a.
Pembuatan Fase Gerak
1)
Diukur volume eluen yang
dibutuhkan berdasarkan volume chamber.
2) Setelah eluen dibuat, dimasukkan ke dalam chamber, ditutup dan
dibiarkan sampai jenuh dengan kertas saring
b.
Preparasi Sampel
1. Sampel jamu ditimbang 250 mg, diekstraksi dengan menggunakan pelarut
metanol dalam labu 25 mL. Larutan disonikasi selama 30 menit
2. Diendapkan dengan sentrifuge 300 rpm selama 10 menit, diambil
supernatan dan masukkan kedalam labu 25 mL dan disonikasi kembali selama 30
menit
3. Hasil ekstrak ditotolkan pada plat KLT 3 μL dengan menggunakan fasa
gerak dibandingkan dengan standar. Lihat bercak yang dihasilkan dibawah lampu
UV pada λ = 245 nm. Berikan tanda pada bercak yang dihasilkan. Tentukan harga
Rf dari bercak semua bercak yang muncul
c. Pembuatan Kurva
Baku
1) Dibuat kurva baku yang diperoleh dari pengukuran campuran parasetamol
dan fenil butason standar dengan konsentrasi masing-masing 10, 20, 40, 60,
80, dan 100 ppm
2) Digunakan pelarut metanol. Kurva diperoleh dari luas area vs kadar
3) Tulis perhitungan pengenceran pembuatan larutan
seri kadar standart masing-masing pada lembar kerja
d.
Optimasi Panjang Gelombang Maksimal
1. Optimasi λ max dilakukan dengan cara scanning λ max dari spotkurva baku
parasetamol dan fenilbutason dipermukaan plat silika dengan menggunakan
detektor UV yang terdapat dalam densitometer
2. Cetak dan catat hasil scan λ pada lembar kerja
e. Penetapan Kadar
Sampel
1)
Sampel ditotolkan pada plat
silika gel 60 F254 sebanyak 3 totolan dengan volume 2 μL
2)
Kemudian dimasukkan dalam
chamber untuk dielusi dengan eluen sampai batas yang ditentukan yaitu 1 cm dari
atas plat
3)
Setelah dikeringkan, spot
dalam plat silika dianalisis dengan densitometer dan akan diperoleh data berupa
nilai AUC dari sampel
4)
Perhitungan kadar sampel
dilakukan dengan memasukkan nilai AUC sampel ke persamaan regresi linier dari
kurva baku, y = bx + a. Nilai y merupakan AUC sampel, x adalah konsentrasi/
kadar, b merupakan slope/kemiringan dan a adalah intersep
5)
Buat
kurva baku konsentrasi vs AUC. Hitung persamaan regresi linier dan R2 !
f. Penetapan Kadar Sampel
1. Lakukan perhitungan akurasi dan presisi sesuai kriteria pada ICH
2. Buat sampel spike dan standart adisi beserta penentuan repeatability intraday. Hitung parameter akurasi dan presisnya !
IV. Cara Kerja (Realisasi)
a.
Pembuatan Fase Gerak
1) Dibuat fase gerak sebanyak 20 ml kloroform : aseton (80:20)
2) Kemudian dicampur dalam lemari asam dan dimasukkan dalam chamber, ditunggu sampai jenuh (45 menit)
b.
Preparasi Sampel
1. Sampel jamu ditimbang 250 mg, diekstraksi dengan menggunakan pelarut
metanol dalam labu 25 mL. Larutan disonikasi selama 30 menit
2. Diendapkan dengan sentrifuge 300 rpm selama 10 menit, diambil
supernatan dan masukkan kedalam labu 25 mL dan disonikasi kembali selama 30
menit
3. Hasil ekstrak ditotolkan pada plat KLT 3 μL dengan menggunakan fasa gerak dibandingkan dengan standar. Lihat bercak yang dihasilkan dibawah lampu UV pada λ = 245 nm. Berikan tanda pada bercak yang dihasilkan. Tentukan harga Rf dari bercak semua bercak yang muncul
Pembuatan Standar
Fenilbutason Dan Paracetamol
·
Parasetamol
1. Ditimbang 25 mg paracetamol murni
2. Dilarutkan dengan menggunakan metanol
3. Dimasukkan dalam labu 25 ml dan di add sampai tanda batas
·
Fenibutason
1. Ditimbang 25 mg fenibutason
murni
2. Dilarutkan dengan menggunakan metanol
3. Dimasukkan dalam labu 25 ml dan di add sampai tanda batas
c. Pembuatan Kurva
Baku
1) Dibuat kurva baku yang diperoleh dari pengukuran campuran parasetamol dan fenil butason
2) Dibuat kurva baku yang diperoleh dari pengukuran campuran parasetamol dan fenil butason standar dengan konsentrasi masingmasing 10, 20, 40, 60, 80, dan 100 ppm
3) Dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL
4) Diadd dengan menggunakan methanol sampai tanda batas
5) Tulis perhitungan pengenceran pembuatan larutan
seri kadar standart masing-masing pada lembar kerja
d.
Optimasi Panjang Gelombang Maksimal
1. Optimasi λ max dilakukan dengan cara scanning λ max dari spotkurva baku
parasetamol dan fenilbutason dipermukaan plat silika dengan menggunakan
detektor UV yang terdapat dalam densitometer
2. Cetak dan catat hasil scan λ pada lembar kerja
e. Penetapan Kadar
Sampel
1)
2)
3)
4) Setelah dikeringkan, spot dalam plat silika dianalisis dengan densitometer dan akan diperoleh data berupa nilai AUC dari sampel
5) Perhitungan kadar sampel
dilakukan dengan memasukkan nilai AUC sampel ke persamaan regresi linier dari
kurva baku, y = bx + a. Nilai y merupakan AUC sampel, x adalah konsentrasi/
kadar, b merupakan slope/kemiringan dan a adalah intersep
5)
Buat
kurva baku konsentrasi vs AUC. Hitung persamaan regresi linier dan R2 !
f. Penetapan Kadar Sampel
1. Lakukan perhitungan akurasi dan presisi sesuai kriteria pada ICH
2. Buat sampel spike dan standart adisi beserta
penentuan repeatability intraday. Hitung parameter akurasi dan presisnya !
V. Perhitungan
1.
Pembuatan Standart
Parasetamol dan Fenilbutazon
a.
Standart Parasetamol
1000 ppm
1000 mg/1000
ml = x mg / 25 ml
x = 25 mg
b. Standart Parasetamol 1000 ppm
1000 mg/1000
ml = x mg / 25 ml
x = 25 mg
2) Perhitungan Pembuatan Kurva Baku Masing-Masing
Konsetrasi
a. Campuran Parasetamol dan Fenilbutazon Standart
Konsentrasi 100 ppm
M1 x V1 = M2 x V2
1000 ppm x V1 = 100
ppm x 10 ml
V1 = 1 ml
b. Campuran Parasetamol dan Fenilbutazon Standart
Konsentrasi 120 ppm
M1 x V1 = M2 x V2
1000 ppm x V1 = 120
ppm x 10 ml
V1 = 1.2 ml
c. Campuran Parasetamol dan Fenilbutazon Standart
Konsentrasi 140 ppm
M1 x V1 = M2 x V2
1000 ppm x V1 = 140
ppm x 10 ml
V1 = 1.4 ml
d. Campuran Parasetamol dan Fenilbutazon Standart
Konsentrasi 160 ppm
M1 x V1 = M2 x V2
1000 ppm x V1 = 160
ppm x 10 ml
V1 = 1.6 ml
e. Campuran Parasetamol dan Fenilbutazon Standart
Konsentrasi 180 ppm
M1 x V1 = M2 x V2
1000 ppm x V1 = 180
ppm x 10 ml
V1 = 1.8 ml
f. Campuran Parasetamol dan Fenilbutazon Standart
Konsentrasi 200 ppm
M1 x V1 = M2 x V2
1000 ppm x V1 = 200
ppm x 10 ml
V1 = 2 ml
VI. Hasil/Data Pengamatan
|
Kadar |
Area |
|
100 |
1585.6 |
|
120 |
2055.9 |
|
140 |
2350.7 |
|
160 |
2957.7 |
|
180 |
3074.3 |
|
200 |
3254.5 |
Persamaan regresi
linier : y = 17.152x - 26.414
R² = 0.9573
|
a |
26.414 |
|
b |
17.152 |
|
r |
0.9573 |
|
Sampel |
Area |
Kadar |
|
1 |
1099.6 |
65.6491 |
|
2 |
11001.8 |
642.9696 |
|
3 |
11180.4 |
653.3823 |
|
Area |
Kadar |
|
|
Sampel 1 |
6103.8 |
357.4052 |
|
Sampel 2 |
6204.7 |
363.2879 |
|
Sampel 3 |
6100.9 |
357.2361 |
|
Sampel 4 |
6105.9 |
357.5276 |
|
Sampel 5 |
6198.6 |
362.9323 |
|
Sampel 6 |
6158 |
360.5652 |
|
Sampel 7 |
6120.9 |
358.4022 |
|
Rata-Rata |
6141.829 |
359.6224 |
|
SD |
2.6384 |
|
|
RSD/CV |
0.7337 |
|
Prinsip dasar Kromatografi Lapis Tipis (KLT) yaitu suatu campuran senyawa dilarutkan dalam solvent yang tepat kemudian ditotolkan dalam fase diam dan dielusi dengan fase gerak. Prinsip pemisahan terjadi karena setiap zat mempunyai kemampuan berinteraksi dengan fase diam yang berbeda-beda satu sama lain. Senyawa yang mempunyai afinitas yang lebih besar dari fase diam mka akan berinteraksi lebih kuat dan lebih lama. Senyawa yang mempunyai afinitas yang kurang besar terhadap fase diam maka akan berinteraksi kurang kuat dan tidak terlalu lama. Jika pelarut bersifat polar, maka fase diamnya akan bersifat nonpolar.
Gambar 1
Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Identifikasi spot KLT, antara lain :
a. RF
b. Non Destruktik : tidak merusak KLT
c. Destruktif : merusak KLT
Linomat digunakan untuk menotolkan sampel ke plat silica secara otomatis. Penggunaan Lensinometer bertujuan agar diperoleh hasil yang akurat seperti ukuran dan lebar totolan.
Densitometer digunakan untuk menginterprestasikan hasil dari plat silica berupa nilai RF dan AU.
Terdapat juga analisis kualitatif dan analisis kuantitatif. Pada analisi kualitatif akan diperoleh nilai RF. Sedangkan analisis kuantitatif akan diperoleh nilai AUC.
Ultrasonicator digunakan untuk membantu memperkecil partikel dalam sampel.
Cara membaca kromatogram yaitu pertama liat puncak yang berdiri sendiri, kemudian dilihat puncak berada dalam substance berapa, dari substance tersebut akan diperoleh nilai area dan nilai RF (liat max RF). Berdasarkan hasil kurva baku dapat disimpulkan bahwa, semakin tinggi konsentrasi maka semakin besar areanya.
VIII. Kesimpulan
1. Prinsip dasar Kromatografi Lapis Tipis (KLT) yaitu . Aplikasi Kromatografi Lapis Tipis (KLT) antra lain untuk kendali mutu tumbuhan obat, identifikasi tumbuhan obat, standarisasi produk obat herbal, tahapan dalam analisi sidik jari KLT, dan preparasi sampel.
2. Pemilihan metode kromatografi (KLT-Densitometri) untuk analisis Bahan Kimia Obat dalam jamu, karena metode KLT merupakan metode yang sederhana dn cepat. KLT digunakan secara luas untuk analisis obat.
3. Terdapat analisis kualitatif dan analisis kuantitatif dalam praktikum kali ini. Pada analisi kualitatif akan diperoleh nilai RF. Sedangkan analisis kuantitatif akan diperoleh nilai AUC.
4. Validasi metode analisi yang dilakukan pada percobaaan ini adalah presisi. Presisi ditentukan berdasarkan nilai % CV. Berdasarkan perhitungan diperoleh nilai % CV sebesar 0.7337 %. Hal tersebut menunjukkan nilai % CV bagus , karena menurut literature nilai % CV yang bagus ≤ 2%. Sehingga dapat dikatakan data tersebut presisi.
Rafi, M. dkk., 2017., Atlas Kromatografi Lapis Tipis Tumbuhan Obat Indonesia Volume 1., Bogor : IPB-Press.
Wirastuti, A. dkk., 2016., Pemeriksaan Kandungan Bahan Kimia Obat (BKO) Prednison Pada Beberapa Sediaan Jamu Rematik., Jurnal Fitofarmaka., 3(1):130-134.
Wulansari, Y. D., 2011., Validasi Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) – Desnsitometer Pada Penetapan Kadar Kurkumin Dalam Sediaan Cair Obat Herbal Terstandart (OHT) KitantiR., Skripsi., Fakultas Farmasi., Universitas Sanata Dharma.