AMPLIFIKASI DNA (PCR) DAN PENYUSUNAN PRIMER

  

LAPORAN PRAKTIKUM

AMPLIFIKASI DNA (PCR) DAN PENYUSUNAN PRIMER

 

Oleh :

                                                   Dinda Yulia Wahyuni Bahri

                                                                 18613114

                                                                       C1

 

 

Program Studi Farmasi

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Islam Indonesia

2020

______________________________________________________________________

I.          TUJUAN

1. Tujuan PCR : Mampu melakukan teknik sintesis dan amplifikasi DNA secara in vitro
2. Tujuan penyusunan primer : Untuk menganalisis DNA agar dapat memperoleh hasil infikasi yang spesifik

 

II.        ALAT DAN BAHAN

A.    Analisis kuantitatif DNA hasil isolasi dengan spektrofotometri

    Alat

       1.       Blue tip

       2.       Kuvet

       3.       Mikropipet

       4.       Spektrofotometer

       5.       Yellow tip

 

    Bahan

       1.       Aquades

       2.       DNA hasil isolasi

 

B. Amplifikasi DNA hasil isolasi dengan metode PCR

    Alat

       1.      Mikropipet

       2.      Thermal cycler

       3.      Tube mikrosentrifus

       4.      Yellow tip

 

    Bahan

       1.      Aquades

       2.      DNA hasil isolasi

 

III.      CARA KERJA DAN HASIL

       A. Cara kerja PCR

 

Protokol P2

Virtual Lab

Sebelum diamplifikasi dengan PCR dilakukan uji kuantitatif terlebih dahulu Analisis kuantifikasi DNA hasil isolasi dengan spektrofotometer    Di pipet 5 μl sampel DNA hasil isolasi, tambahkan aquadest secukupnya sehingga volume akhir 1 ml. Campur kemudian pindahkan ke dalam kuvet spektrofotometri ↓ Blangko spektrofotometer dengan kuvet berisi 1 ml aquadest ↓ Dibaca absorbansi sampel dengan spektrofotometer pada 260 nm.                                     ↓ Dilakukan pembacaan absorbansi yang ke-2 pada 280 nm ↓ Ditentukan rasio absorbansi pada 260 nm dan 280 nm (hasil absorbansi 260 nm : hasil absorbansi 280 nm) ↓ Dihitung konsentrasi DNA untai sampel, dan tentukan konsentrasi DNA yang diperoleh  B. Amplifikasi DNA hasil isolasi dengan metode PCR Dibuat campuran reaksi sesuai resep ↓ Dimasukkan campuran reaksi ke thermal cycler ↓ Dilakukan setting thermal cycler dengan parameter yang ditentukan ↓ Running PCR dan tunggu hingga proses selesai ↓ Hasil PCR disimpan pada -20°C ↓ Dilakukan analisis hasil PCR dengan elektroforesis gel agarose 2%

Buka account google, kemudian ketik pada pencarian NCB ↓          Pada halaman web lakukan pencarian gene bagian ACTB                         ↓              Di klik bagian ACTB homosapiens    → FASTA                                ↓           Copy beberapa bagian kode gen                                ↓ Buka tab baru, ketik pada pencarian    “Primer 3”                                ↓           Masukkan kode gen yang telah di copy ke dalam kolom yang yang ada pada halaman web                                ↓ Klik “Pick Primers” yang berwarna hijau                                ↓ Lalu akan muncul beberapa “pair” ↓ Copy hasil data yang telah diperoleh sebagai bahan pembuatan laporan

 

B. Penyusunan prime

     1. Fungsi gen :

Fungsi gen adalah untuk menyampaikan informasi mengenai genetika dari generasi ke generasi, mengontrol dan mengatur metabolisme dan perkembangan tubuh, menentukan sifat-sifat pada keturunannya dan proses kimia di dalam tubuh dapat secara berurutan. Selain itu fungsi gen yaitu untuk menyampaikan informasi genetik dari generasi ke generasi (dari induk kepada keturunanya), mengontrol dan mengatur proses metabolisme dan perkembangan tubuh serta menentukan sifat pada keturunannya (Ramlawati,dkk.2017).

     2. Distribusi ekspresi gen pada tubuh manusia:

Adrenal, appendix, sumsum tulang, otak, usus besar, usus dua belas jari, endometrium, kerongkongan, lemak, kantung empedu, jantung, ginjal, hati, paru-paru, kelenjar getah bening, indung telur, pankreas, plasenta, protat, kelenjar ludah, kuit, usus halus, limpa, perut, testis, tiroid, kandung kemih

 

     3. Letak gen dalam kromosom :

Gen GADPH Homo sapiens terletak pada kromosom 12, GRCh38.p13 dengan kode NC_000012.12 dan NC_000012.1

 

     4. FASTA:

TGGCGGAGCC  CCGCACCCAG  GCTGTGGCGC  CCTGTGCAGC  TCCGCCCTTG

CGGCGCCATC  TGCCCGGAGC  CTCCTTCCCC  TAGTCCCCAG  AAACAGGAGG

TCCCTACTCC  CGCCCGAGAT  CCCGACCCGG  ACCCCTAGGT  GGGGGACGCT

TTCTTTCCTT  TCGCGCTCTG  CGGGGTCACG  TGTCGCAGAG  GAGCCCCTCC

CCCACGGCCT  CCGGCACCGC  AGGCCCCGGG  ATGCTAGTGC  GCAGCGGGTG

CATCCCTGTC  CGGATGCTGC  GCCTGCGGTA  GAGCGGCCGC  CATGTTGCAA

CCGGGAAGGA  AATGAATGGG  CAGCCGTTAG  GAAAGCCTGC  CGGTGACTAA

CCCTGCGCTC  CTGCCTCGAT  GGGTGGAGTC  GCGTGTGGCG  GGGAAGTCAG

GTGGAGCGAG  GCTAGCTGGC  CCGATTTCTC  CTCCGGGTGA  TGCTTTTCCT

AGATTATTCT  CTGGTAAATC  AAAGAAGTGG  GTTTATGGAG

     5. Jumlah pasangan primer yang direkomendasikan primer 3:

Terdapat 5 primer 

 

C.         PEMBAHASAN

     1. Bandingkanlah proses replikasi DNA dalam sel eukariot dengan yang terjadi                 dalam metode PCR (dapat dibuat dalam tabel)

Sel Eukariot	PCR
Denaturasi Inisiasi Elongasi Ligasi Terminasi	Pre-denaturasi Denaturasi Annealing Extension Post extension Cooling

a.   Denaturasi

Untai ganda membuka menjadi 2 untai tunggal karena suhu denaturasi yang tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen di antara basa komplemen. Pada tahap ini semua enzim tidak berjalan. Dilakukan pada suhu 90°C-95°C.

b.   Annealing (Penempelan primer)

Primer menuju daerah spesifik yang komplemen dengan urutan primer, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan komplemen pada template. Dilakukan pada suhu 50°C - 60°C.

DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hydrogen akan sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan tahap selanjutnya.

c.   Extension (Polimerase)

Terjadi pada suhu 72°C. Primer yang telah menempel akan mengalami perpanjangan pada sisi 3’ dengan penambangan dNTP yang komplemen dengan DNA polymerase (Handoyo. D, 2010).

 

     2. Sebutkan fungsi masing-masing reagen yang digunakan dalam amplifikasi DNA!

a. MgCl2 : Sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulus aktivitas DNA polymerase dan meningkatkan interaksi primer dengan template yang membentuk kompleks larut dengan dNTP (senyawa antara).

b.   dNTPs (deoxynucleotide triphosphates) :  Sebagai building block  DNA yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA.

c.   Primer : Sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3’ yang diperlukan untuk proses eksistensi DNA

d.   Enzim polimerase DNA : sebagai katalisis untuk reaksi polimerisasi DNA

 

     3. Apakah primer yang Anda dapatkan dari primer 3 sudah memenuhi kriteria                 sebagai primer yang sesuai? Terangkan mengenai hal tersebut!

Dari percobaan aplikasi primer 3 kita mendapatkan primer forward dan primer reserve yang saling berpasangan, karena DNA terdiri dari 2 template/untai maka memerlukan sepasang primer. Primer yang didapatkan ada 5 pasang pair primer. Primer yang disajikan pada kolom paling atas merupakan primer terbaik dan direkomendasikan oleh software ini.

Primer yang baik memiliki karakteristik panjang 15-30 bp. Tm (suhu anneling) 55-60°C dengan GC content maksimal 60%, tidak ada kemampuan dimerisasi, tidak ada pembentukan jepit rambut yang signifikan (>3bp), kurangnya situs priming skunder dalam template dan pengikatan spesifik rendah pada ujung 3’ untuk menghindari kesalahan penulisan

Berdsarkan penjelasan diatas dapat dikatakan bahwa primer yang saya peroleh memenuhi kriteria beberapa pair primer memenuhi kriteria seperti Tm antara 55-60°C dan GC content dibawah 60% serta ANY dibawah 5.0

     4. Cantumkan hasil penempelan primer pada gen (wajib gambar harus tercantum disini)   

  

D.         KESIMPULAN

     1. Fungsi PCR adalah:

Sebagai amplifikasi urutan nukleotida, menentukan kondisi urutan nukleotida

 

     2. Fungsi NCBI dan primer 3 adalah:

Fungsi NCBI adalah untuk mempermudah peneliti dan ilmuwan dalam mengambil data yang dibutuhkan, khususnya dalam bidang biomedis dan genom. Sedangkan Fungsi primer 3 adalah untuk menentukan primer yang tepat.

______________________________________________________________________

DAFTAR PUSTAKA

Handoyo Darmo dan Ari. R ., 2001. PRINSIP UMUM DAN PELAKSANAAN POLIMERASE CHAIN REACTION (PCR). Unitas. 9(1):17-29

 

Pahlevi. M.R., 2016. DESAIN PRIMER UNTUK IDENTIFIKASI GEN GMDREB2 PADA KEDELAI. Jurnal Agrinis. 1(1):1-8

 

Ramlawati,dkk.2017. Pewarisan Sifat Makhluk Hidup. Kementrian Pendidikan dan Kebudayaan