ELEKTROFORESIS

 

LAPORAN PRAKTIKUM

ELEKTROFORESIS

 

Oleh :

                                                   Dinda Yulia Wahyuni Bahri

                                                                 18613114

                                                                       C1

 

 

Program Studi Farmasi

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Islam Indonesia

2020

______________________________________________________________________

I.              TUJUAN

1.      Mampu melakukan analisis kuantitatif DNA mamalia hasil isolasi dengan elektroforesis

2.      Mampu melihat polimorfisme gen GSTM1 dan GSTP1 pada manusia melalui pegamatan gel elektroforesis DNA hasil amplifiikasi dengan PCR dan RFLP  

 

II.           ALAT DAN BAHAN (sesuai protokol pada buku petunjuk praktikum)

Alat

1.      Cetakan gel (combs dan tray)

2.      Gel doc

3.      Gelas ukur

4.      Labu Erlenmeyer 100 mL

5.      Mikrowave/hot plate stirrer

6.      Mupid elektroforesis

7.      Pipet p10, p20

8.      Sendok

9.      Timbangan analitik

Bahan

Bahan Habis Pakai                                                    Reagen

1.      Kertas parafilm                                                           1. Agaros gel

2.      Kertas timbang                                                            2. Buffer elektroforesis

3.      Kertas tisu                                                                   3. Loading buffer

4.      Pipet tip 10μl, 20μl                                                     4. TBE 5X (perliter)

·         Aqua bidestilata          add 1 L

·         Asam borat                  27,5 g

·         EDTA 0,5 M (pH 8,0) 20 mL

·         Tris basa 0,45 M          54 g

III.        CARA KERJA DAN HASIL 

 

Protokol P3

Virtual Lab

1.      Pembuatan gel agarose 0,8% atau 1,5% Tuang 50 mL buffer TBE 1X kedalam labu ukur                          ↓ Tuang dalam erlenmeyer                          ↓ Timbang 0,4 g Agarose (konsentrasi 0,8%) gel elektroforesis                          ↓ Masukkan dalam 50 mL buffer TBE 1X, campur                          ↓ Panaskan dengan microwave atau hot plate stirrer ↓ Sambil diaduk hingga agarose larut dalam buffer TBE 1x ↓ Tambahkan 5 μl ethidium bromide, hingga semua laut   ↓ Tuang kedalam cetakan yang sudah disiapkan  ↓ Tunggu hingga gel mengeras     2.        Running Elektroforesis Tuang 400 mL buffer TBE 1X kedalam gelas ukur ↓ Tuang dalam chamber mupid elektroforesis Masukkan gel yang sudah jadi dalam buffer TBE 1X (dalam chamber)  ↓ Ambil kertas parafilm untuk membuat mix 2 μl loading buffer ditambah 5 μl produk PCR  ↓ Ambil 7 μl mix (loading+produk PCR), masukkan kedalam sumuran gel dengan hati-hati  ↓ Tutup mupid, tekan tombol pengaturan waktu 30 menit, tombol voltase 100 volt  ↓ Tekan tombol “RUN”  ↓ Setelah selesai matikan alat dengan menekan tombol “RUN”  ↓ Buka tutup mupid, angkat gel, lepaskan tray dari gel  ↓ Lihat hasil running elektroforesis dibawah sinar Uv (Gel.Doc 1000)  ↓ Foto hasil, kemudian diedit dengan computer

1.      Penyiapan Agarose   Encerkan 0,1 ml buffer ad 50 ml kedalam labu ukur  ↓ Campurkan 0,39 g serbuk agarose  ↓ Larutkan serbuk agarose menggunakan mikrowave  ↓ Setelah larut diamkan larutan agarose  ↓ Siapkan cetakan gel  ↓ Tuangkn larutan yang sudah dingin kedalam cetakan dan diamkan selama 20 menit  ↓ Lepaskan tutup ujung dan sisir.   2.      Running elektroforesis  Siapkan chamber elektroforesis, ↓ Tambahkan larutan buffer ke dalam chamber ↓ Masukkan sampel DNA ke dalam gel agarose ↓ Pasang penutup chamber ↓ Nyalakan alat dan dilakukan proses elektroforesis   Catatan : Setelah elektroforesis selesai, diambil gel dan chamber dari ruang elektroforesis dan divisualisasi hasilnya

 

3.             PEMBAHASAN

 

            1. Jelaskan berdasarkan sturktur senyawa dan bentuk molekulnya, mengapa DNA dapat                    dipisahkan dengan elektroforesis!

    Elektroforesis DNA adalah teknik untuk memisahan sampel DNA berdasarkan atas ukuran(bentuk molekul) dan struktur senyawanya. Berdasarkan struktur senyawa, karena DNA mempunyai gugus fosfat yang bermuatan negative, sehingga didalam medan listrik akan bermigrasi melalui matik gel menuju kutub positif (anode). Sedangkan berdasarkan  ukuran(bentuk molekul), dengan menggunakan gel agarose maka dapat dilakukan pemisahan sampel DNA dengan ukuran(bentuk molekul)dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb) dan semakin besar ukuran(bentuk molekul), maka semakin rendah laju migrasinya (Fuad. A. R. M, dkk, 2016).

            2. Jelaskan yang dimaksud dengan

A. PCR product size   : Merupakan ukuran produk PCR dalam pengujian gen. Ukuran tergantung pada                                        urutan ketika mendesain primer

B. Amplikon               : Merupakan DNA target yang telah digandakan (Campbell. Recee. Dkk, 2002)

C. bp                           : Jumlah pasangan basa nitrogen pada DNA rantai tunggal

D. DNA ladder            : Merupakan penggaris untuk DNA sampel yang berbentuk seperti tangga.                                                  DNA ladder digunakan pada elektroforesis untuk menentukan ukuran dan                                                kuantitas dalam pengujian DNA genom plasmid dan PCR

E. House keeping gene : Merupakan sekumpulan gen yang terekspresi terus menerus yang diperlukan                                             untuk menjaga fungsi-fungsi dasar sel. Gen-ge ini senantiasa bekerja                                                         sepanjang kita hidup (Yuwono T. 2005)

            3. Bahas selengkap mungkin hasil PCR yang dihasilkan berdasarkan pemisahan yang                         terjadi pada elektroforesis berikut ini! Apakah gen target berhasil diamplifikasi?

Pada sampel 1, 2 , dan 3 berhasil diamplifikasi karena dapat terlihat adanya migrasi dan ukuran DNA sebesar 500 bp sehingga akan muncul pita. Sedangkan pada sampel nomor 4 tidak berhasil karena tidak terdapat DNA sehingga tidak muncul pita pada elektoforesis. Adanya pita mengindikasikan bahwa sampel tersebut mengandung suatu DNA. Oleh karena itu, saat suatu sampel tidak terdapat pita maka dikatakan sampel tersebut tidak mengandung DNA

            3. Jika pita dari gen yang diamplifikasi ternyata tidak muncul, jelaskan penyebab                                mengapa hal tersebut dapat terjadi!

    Dapat disebabkan oleh beberapa hal, seperti gennya tidak teramplifikasi dengan sempurna tidak berhasil (tidak sesuai target) dan  PCR yang digunakan mengalami kesalahan atau tidak terjadi proses isolasi

    Hal tersebut dapat diatas dengan : jika menggunakan elektroforesis maka dapat dilihat pergerakannya jadi jika tidak ada pergerakannya maka artinya proses tersebut tidak berhasil

    Kesimpulannya  :  Hal ini disebakan oleh tidak terdapatnya DNA dalam senyawa tersebut, karena DNA dapat dilihat tergantung dari jumlah pitanya, semakin banyak pita yang muncul maka semakin banyak pula DNA yang terdapat didalam senyawa tersebut. Jika DNA tidak terdapat dalam senyawa tersebut maka tidak terjadi pergerakan dan pitanya tidak muncul (tidak ada).

 

4.             KESIMPULAN

     Fungsi elektroforesis : untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA, plasmid dan produk PCR

___________________________________________________________________

DAFTAR PUSTAKA

 

Campbell, Recee, dkk. 2002. BIOLOGI ALIH BAHASA. Jakarta: Penerbit Erlangga

Fuad. A. R. M, dkk, 2016., PENGGUNAAN AGAR-AGAR KOMERSIAL SEBAGAI MEDIA GEL ELEKTROFORESIS PADA ZAT WARNA REMAZOL : PENGARUH KOMPOSISI BUFFER, PH, BUFFER DAN KONSENTRASI MEDIA. Jurnal Sains Dan Seni Its. 5(2):130-133.

 

Rahardianti. R dan Nur. E. M, 2017., AKURASI METODE REAL PCR UNTUK ANALISIS EKSPRESI GEN PmVRP15. Prosiding Pertemuan Teknis Teknisi Litkayasa Lingkungan Bbpbap. Jepara : Balai Besar Perikanan Budidaya Air Payau Jepara.

 

Sinaga, dkk. 2017. ANALYSIS OF PCR AMPLIFICATION OF SUMATRA’S ANDALIMAN BASED ON RAPD PRIMER OPD 03, OPD 20, OPC 07, OPM 20, OPN 09. Jurnal Agroteknologi FP USU . 5(1).